Test sul modello

Il liquido di coltura addizionato di aerosol di sigaretta elettronica è quindi “pronto” per essere messo a contatto con il modello cellulare. Tecnicamente il liquido di coltura contenente il condensato viene a contatto con co-colture tridimensionali di cellule epiteliali alveolari (NCI-H441) ed endoteliali del microcircolo polmonare umano (HPMEC).

I tempi e i modi di esposizione del modello cellulare al terreno sono fedeli alle indicazioni dei protocolli pubblicati sulla letteratura scientifica internazionale in modo da generare risultati confrontabili con quelli già disponibili nel panorama scientifico.
Trascorso il tempo di esposizione, si misurano gli effetti sulle cellule tramite tre diverse tipologie di indagine: test di vitalità/tossicità cellulare, di misurazione della resistenza elettrica transmembrana, e di quantificazione dei mediatori dell’infiammazione.

A) TEST DI VITALITÁ/TOSSICITÁ CELLULARE

viola Il modello cellulare è sottoposto a test di vitalità cellulare realizzati con l’ausilio di “alamarBlue®”, un reagente che si basa su un processo molto semplice e affidabile. Una molecola di piccole dimensioni, di colore blu (Resazurina) penetra la membrana della cellula e viene a contatto con l’ambiente interno. Se la cellula è in buono stato di salute, i processi che normalmente avvengono al suo interno sono in grado di convertire la Resazurina in una molecola differente (Resorufina), di colore rosa.

01_CITOLTale processo è tanto più efficace quanto più una cellula è in salute e, al contrario, risulterà meno efficace se la cellula si trova in stato di sofferenza.
Attesi i tempi necessari per una completa reazione delle cellule, si misura la quantità di Resorufina (la forma fluorescente) tramite lettura della fluorescenza allo spettrofotometro e si potranno così misurare il livello di vitalità cellulare del modello e il conseguente grado di tossicità del liquido iniziale.

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B) MISURAZIONE DELLA RESISTENZA ELETTRICA TRANSEPITELIALE

terrAll’interno dei tessuti le cellule che li compongono normalmente creano strutture di adesione che le mantengono salde tra loro e in grado di trasmettersi messaggi.
La riduzione dell’adesione tra le cellule, con potenziali gravi conseguenze per i tessuti.

Il grado di adesione può essere misurato come la capacità delle cellule di impedire il passaggio di corrente. Per calcolarlo è necessario applicare due elettrodi a cavallo della struttura cellulare: maggiore il passaggio di corrente rilevato, maggiore sarà l’effetto tossico della sostanza che è stata a contatto con le cellule tramite il terreno di coltura.


C) QUANTIFICAZIONE DEI MEDIATORI DELL’INFIAMMAZIONE

In presenza di un fattore di stress (fumo di sigaretta, alcol, virus, patogeni, parassiti, ecc) le cellule del corpo umano reagiscono rilasciando molecole che mediano il processo infiammatorio. Tra le più importanti sono da segnalare quelle appartenenti alla famiglia delle interleuchine “IL”, in particolare la IL-6 e la IL-8.
L’infiammazione è un processo molto complesso, controllato da numerosi fattori, che può coinvolgere interi organi. Lo scopo del processo infiammatorio è quello di richiamare l’attenzione del sistema immunitario e, nella sede del fattore di stress, di attivare le cellule più competenti in grado di risolvere il problema. Questo processo normalmente richiede del tempo ed esita in una completa guarigione (pensiamo per esempio al risolversi di una ferita o di una infezione locale).

Se il fattore di stress permane per lungo tempo, oltre agli effetti diretti dovuti all’esposizione cronica a questo fattore possono insorgere anche ulteriori conseguenze collaterali dovute alla continua risposta infiammatoria che il corpo mette in atto per difendersi. Un sistema immunitario troppo stimolato infatti può iniziare a colpire anche le cellule dell’ospite con ricadute sulla salute.

Numerosi studi hanno già ampiamente dimostrato che la sigaretta tradizionale ha notevoli effetti da questo punto di vista a causa del potere pro-infiammatorio di diverse molecole presenti nel fumo e alla ripetizione quotidiana dell’attività del fumatore.

Per valutare se i prodotti per lo svapo possono causare gli stessi effetti del fumo in tutto il tessuto polmonare, vengono misurate le quantità di interleuchina 8 tramite test basati sulla tecnologia immunoenzimatica (ELISA) sia nel comparto apicale (dove si sviluppano le cellule polmonari) sia nel comparto basale (dove si sviluppano le cellule dell’endotelio).

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